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? 生涯条件

液氮生涯

? 细胞苏醒要领

注重：收到的细胞如 24h 内苏醒，可存放于-80℃冰箱；凌驾 24h 请存放于液氮中，苏醒前 10min 取出，放于-80℃，让管中液氮挥发。
1．水浴锅 37℃预热；
2．适合该细胞系的完全作育基温浴到 37℃；
3．在 15mL 离心管中加入 6mL 完全作育基备用；
4．从-80℃冰箱中取出细胞，在 37℃水浴中轻轻转动冻存管，直到冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞在 1min 内迅速解冻（水不可没过盖子或用封口膜把冻存管口封上）；
5．将冻存管转移到超净事情台内；翻开盖子前，用 75％酒精擦拭冻存管外部；
6．用移液枪吸收细胞冻存悬液，转移至已预热的完全作育基的离心管内；
7．用 1mL 完全作育基洗涤冻存管 1 次，网络残留细胞，镌汰损失；
8． 细胞悬液以 1100rpm 离心 4min（离心速率和时间取决于细胞种类）
9．离心后，检查上清液是否清亮，有无完整的细胞沉淀；在无菌条件下，小心倒掉上清液，加入 1mL 完全作育基，轻柔奏乐细胞沉淀，充分吹散、混匀；
10．将细胞平均接种到 1 个 T25 作育瓶或底面积相当的作育容器中。加入足量完全作育基，1 个 T25 作育瓶中作育基总量不少于 6mL（现实作育瓶尺寸取决于冻存管冻存的细胞数目）；
11．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的作育箱中（作育情形取决于细胞和作育基类型）；
12．苏醒越日，视察细胞状态。
（1）贴壁细胞若细胞贴壁情形优异，可以替换新鲜的完全作育基；若视察到细胞呈圆亮形态但不贴壁，可以让细胞继续作育 24h 后再举行换液操作。之后，凭证细胞的生长状态，每2-3 天替换一次完全作育基，视察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代。若细胞生长较慢或汇合度较低时，可以镌汰换液次数。
（2）悬浮细胞苏醒后只管放在相对小一些的容器中，使用含 20％血清的作育基苏醒。悬浮细胞若细胞状态优异，可以替换新鲜的完全作育基；若细胞状态差且泛起灰度，可以继续作育 72h 后再视察细胞。视察发明有活细胞，可举行换液操作，视察细胞无显着转变，实时反响本公司售后。

? 细胞传代要领

1．将完全作育基、PBS、胰酶预热至 37℃；
2．从作育容器中吸弃上清；
3．从容器一侧轻轻加入冲洗液 PBS（T25 作育瓶加入约 6mL）洗涤细胞 1 次。注重行动轻柔，洗濯周全，阻止搅动细胞层，前后摇晃容器数次吸去 PBS（注：冲洗办法可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁）；
4．加入胰酶（T25 作育瓶加入约 3mL），迅速铺匀，包管充分接触细胞外貌。放入作育箱消化；
5．显微镜下视察消化情形，约 70％～80％细胞缩短变圆后，轻拍作育容器外壁，使细胞脱离作育外貌；
6．连忙加入 2 倍胰酶体积的完全作育基（T25 作育瓶加入约 6mL），随即轻摇作育容器，使作育基和胰酶迅速混匀，终止消化；
7．使用移液管吸收细胞悬液，奏乐作育容器底面数次，尽可能将细胞都奏乐下来；注重：吹感行动不可强烈，阻止爆发大宗气泡，损伤和损失细胞。
8．将细胞悬液转移至离心管中。用 PBS（T25 作育瓶加入约 3mL）洗涤容器 1 次，网络残留细胞；
9．网络的所有细胞悬液以 1100rpm 离心 4min；
10．离心后去除上清。加入 1mL 完全作育基，轻柔奏乐细胞沉淀，充分吹散、混匀；
11．将细胞按一定的比例传代接种，建议首次凭证 1：3 举行传代，若细胞在两天内长满可增添传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例；
注重：请凭证细胞现实生长情形调解传代比例。
12．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的作育箱中（若是使用作育瓶，将其放入作育箱前应将瓶盖旋松，以便举行充分的气体交流，除非您使用的是通气式作育瓶和透气性瓶盖）；
13．传代越日，视察细胞状态。若发明较多死细胞，举行换液操作。之后，每凭证细胞的生长情形替换完全作育基，视察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代或冻存。